ABSTRACT
Background: α-galacto-oligosaccharides, including raffinose and stachyose, are present in soybean meal and used widely as a protein source in poultry diets. These compounds have anti-nutritive effects that ultimately reduce performance and value of birds. Thus, the addition of exogenous α-galactosidase to poultry diets -which can initiate the digestion of these non-digestible sugars- can be an effective strategy to solve the nutritional disorders associated with consumption of these oligosacharides. Solid state fermentation (SSF) has drawn attention for the production of microbial enzymes, due to the possibility of using cheap and abundant agro-industrial residues as substrates. Objective: to present information on α-galactosidase production under SSF conditions by an Antarctic bacterial isolate, Bacillus LX-1. Methods: initially, wheat bran, soybean meal, corn flour and the combinations of these individual substrates with nutritive supplements containing 1% galactose, 0.5% yeast extract, 1% tryptone, and 0.001% MnSO(4)4H2O were evaluated to select an optimal medium in SSF to produce extracellular α-galactosidase. Certain fermentation parameters involving incubation time, moisture content, and initial pH were investigated separately. Additional studies were conducted to evaluate the influence on enzyme production of different carbon sources (glucose, sucrose, galactose, lactose, and maltose) and nitrogen sources (peptone, tryptone, sodium nitrate and ammonium sulfate). Results: a medium containing soybean meal resulted in best α-galactosidase synthesis and was used for further SSF explorations with Bacillus sp. LX-1. Maximum enzyme production was observed at a growth period of 72 h, 75% moisture content and pH 8.0. Enzyme activity was enhanced in the presence of galactose or lactose as the carbon source, and tryptone or peptone as the nitrogen source. Conclusion: this SSF technique could be potentially used to produce α-galactosidase for poultry feed.
Antecedentes: los α-galacto-oligosacáridos, incluyendo rafinosa y estaquiosa, están presentes en la harina de soja, la cual es utilizada ampliamente como fuente de proteína en dietas de aves. Estos compuestos tienen efectos anti-nutricionales que reducen el rendimiento de las aves. La adición de α-galactosidasa exógena a dietas de aves puede iniciar la digestión de esos azúcares, resultando en una estrategia eficaz para resolver los desórdenes nutricionales asociados con el consumo de dichos oligosacáridos. La fermentación en estado sólido (SSF) se puede usar para producir enzimas microbianas, debido a la posibilidad de utilizar residuos agroindustriales abundantes y baratos como sustrato. Objetivo: informar sobre la producción de α-galactosidasas por una bacteria antártica (Bacillus LX-1) bajo condiciones de SSF. Métodos: se evaluaron salvado de trigo, harina de soja, harina de maíz y las combinaciones individuales de estos sustratos con suplementos nutritivos conteniendo 1% de galactosa, 0,5% de extracto de levadura, 1% de triptona y 0,001% de MnSO(4)4H2O para seleccionar un medio óptimo de SSF para producir α-galactosidasa extracelular. Ciertos parámetros de fermentación incluyendo tiempo de incubación, contenido de humedad, y pH inicial se evaluaron por separado. Se realizaron estudios adicionales para evaluar la influencia de diferentes fuentes de carbono (glucosa, sucrosa, galactosa, lactosa y maltosa) y de nitrógeno (peptona, triptona, nitrato de sodio y sulfato de amonio) sobre la producción enzimatica. Resultados: un medio con harina de soja resultó ser el mejor para la síntesis de α-galactosidasa y se utilizó para nuevas exploraciones de SSF con Bacillus sp. LX-1. La producción máxima de la enzima se observó en un periodo de crecimiento de 72 h, a 75% de humedad y pH 8,0. La actividad enzimática mejoró en presencia de galactosa o lactosa como fuente de carbono, y triptona o peptona como fuente de nitrógeno. Conclusión: la técnica de SSF podría ser utilizada para producir α-galactosidasa destinada a la alimentación de aves de corral.
Antecedentes: os α-galacto-oligossacarídeos, incluindo rafinose e estaquiose, estão presentes na farinha de soja, que é amplamente utilizado como uma fonte de proteína em dietas de aves domésticas. Estes compostos têm efeitos anti-nutricionais que reduzem o desempenho das aves. A adição de α-galactosidase exógena em dietas de aves pode começar a digerir estes açúcares, resultando em uma estratégia eficaz para resolver os problemas nutricionais associados com o consumo desses oligossacarídeos. A fermentação em estado sólido (SSF) pode ser usada para produzir enzimas microbianas, devido à possibilidade de utilização de resíduos agroindustriais como substrato abundante e barato. Objetivo: relatar a produção de α-galactosidase por uma bactéria da Antártida (Bacillus LX- 1) em SSF. Métodos: foram avaliados o farelo de trigo, farelo de soja, farelo de milho e combinações específicas destes substratos com suplementos nutricionais contendo 1% de galactose, 0,5% de extrato de levedura, 1% de triptona e 0,001% de MnSO(4)4H2O para selecionar um meio ideal de SSF para produzir extracelular α-galactosidase. Certos parâmetros de fermentação, incluindo tempo de incubação, teor de umidade e pH inicial foram avaliados separadamente. Estudos adicionais foram conduzidos para avaliar a influência de diferentes fontes de carbono (glucose, sacarose, galactose, lactose e maltose) e de azoto (peptona, triptona, nitrato de sódio e sulfato de amónio) na produção da enzima. Resultados: um meio com farelo de soja acabou por ser o melhor para a síntese de α-galactosidase e foi usado para uma maior exploração de SSF com Bacillus sp. LX - 1. A produção máxima da enzima foi observada em um período de crescimento de 72 h, 75% de humidade e pH 8,0. Melhoria da atividade enzimática na presença de galactose ou lactose como fonte de carbono e de triptona e peptona como fonte de azoto. Conclusão: A técnica da SSF poderia ser usada para produzir α-galactosidase para a alimentação de aves domésticas.
ABSTRACT
Background: much recent attention has been devoted to the genuine value of Bacillus species as multifunctional probiotic products, which produce various extracellular enzymes that enhance feed digestibility as well as many antimicrobial compounds for the purpose of improving animal performance. Objective: to describe novel, in vitro potential probiotic properties such as acid tolerance, bile tolerance, safety, and antimicrobial activity of mesophilic and psychrophilic Bacillus strains in conjunction with their extracellular enzymatic activities. Methods: four Bacillus strains (B. sp. T3, B. sp. T4, B. sp. SM2, and B. sp. JSP1) isolated from different sources were used. Strains were identified according to 16S rDNA sequences. Escherichia coli K88, E. coli O157:H7, Salmonella enteritidis KCCM 12021, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, and Staphylococcus aureus were used as indicator bacteria for the antimicrobial activity trial. Strains were activated and cultured in tryptic soy broth (pH 7.0) or broth solidified with 1.5% agar. Results: B. sp. JSP1 was fully resistant to both pH 2 and 3, whereas B. sp. SM2 showed relatively good viability at pH 3. All strains tolerated oxgall (0.3%) bile salt and were not cytotoxic to the HEK 293 human embryonic kidney cells. Three strains, except B. sp. T3, displayed differential production of extracellular enzymes including amylase, xylanase, cellulase, protease, phytase, and α-galactosidase. In particular, B. sp. SM2 inhibited six indicator pathogens: Escherichia coli K88, E. coli O157:H7, Salmonella enteritidis, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, and Staphylococcus aureus. Conclusion: the single use of B. sp. SM2 or the mixed use of the strain combined with acid or bile tolerant Bacillus strains secreting extracellular enzymes may be an alternative to antibiotics as a feed additive in farm animal production.
Antecedentes: recientemente el valor de las especies de Bacillus como productos probióticos multifuncionales ha recibido bastante atención, debido a que estos producen varias enzimas extracelulares que potencian la digestibilidad de los alimentos, así como también compuestos antimicrobianos que mejoran el desempeño del animal. Objetivo: describir y evaluar potenciales propiedades probióticas ''in vitro'' -tales como acidez, tolerancia a la bilis, seguridad y actividad antimicrobiana- de cuatro cepas de Bacilos (B. sp. T3, B. sp. T4, B. sp. SM2 y B. sp. JSP1) aisladas de diferentes fuentes, en conjunción con sus actividades enzimáticas extracelulares. Métodos: se usaron cuatro cepas de Bacillus (B. sp. T3, B. sp. T4, B. sp. SM2, and B. sp. JSP1) aisladas de diferentes fuentes. Las cepas se identificaron de acuerdo a secuencias 16S rDNA. Escherichia coli K88, E. coli O157:H7, Salmonella enteritidis KCCM 12021, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, y Staphylococcus aureus fueron empleadas como bacterias indicadoras para el ensayo de actividad antimicrobiana. Las cepas fueron activadas y cultivadas en caldo soya tripticasa (PH 7.0) o caldo solidificado con 1.5% de agar. Resultados: el B. sp. JSP1 resultó totalmente resistente tanto a pH 2 como a pH 3, mientras que el B. sp. SM2 mostró viabilidad relativamente alta a pH 3. Todas las cepas toleraron oxgall (0.3%) de sales biliares y no resultaron citotóxicas para las células humanas HEK 293 de riñón embrionario. Tres cepas, con excepción de B. sp. T3, presentaron producción diferencial de enzimas extracelulares -incluyendo amilasa, xilanasa, celulasa, proteasa, fitasa y α-galactosidasa. En particular, el B. sp. SM2 inhibió seis indicadores patógenos (Escherichia coli K88, E. coli O157: H7, Salmonella enteritidis, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus). Conclusiones: el uso específico de B. sp. SM2, o el uso combinado de esta cepa junto con cepas secretoras de enzimas extracelulares y tolerantes a ácidos o bilis puede ser una alternativa para reemplazar los antibióticos frecuentemente usados como aditivos en alimentación animal.
Antecedentes: o valor das espécies de Bacillus como produtos probióticos multifuncionais tem recebido bastante atenção recentemente, devido a que produzem várias enzimas extracelulares que potenciam a digestibilidade dos alimentos, como também compostos antimicrobianos que melhoram o desempenho do animal. Objetivo: descrever e avaliar as propriedades potenciais ''in vitro'' - como acidez, tolerância à bile, segurança e atividade antimicrobial- de quatro cepas de Bacilos (B. sp. T3, B. sp. T4, B. sp. SM2, and B. sp. JSP1) isoladas de diferentes fontes, em conjunto com as suas atividades enzimáticas extracelulares. Métodos: foram usadas quatro cepas de Bacillus (B. sp. T3, B. sp. T4, B. sp. SM2, and B. sp. JSP1) isoladas de diferentes fontes. As cepas foram identificadas de acordo às sequências 16S rDNA. As seguintes bactérias foram empregadas como indicadoras no teste de atividade antimicrobiana: Escherichia coli K88, E. coli O157:H7, Salmonella enteritidis KCCM 12021, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes, y Staphylococcus aureus. As cepas foram ativadas e cultivadas em caldo soja tripticase (pH 7.0) ou caldo solidificado com 1.5 de Agar. Resultados: o B. sp. JSP1 foi totalmente resistente tanto no pH 2.0 como no pH 3.0, enquanto que o B. sp. SM2 mostrou viabilidade relativamente alta no pH 3.0. Todas as cepas toleraram oxgall (0.3%) de sais biliares e não foram citotóxicas para as células humanas HEK 293 de rim embrionário. Tres cepas, com exceção de B. sp. T3, apresentaram produção diferenciada de enzimas extracelulares -incluindo amilase, xilanase, celulase, protease, fitase e α-galactosidase. Particularmente, o B. sp, SM2 inibiu seis indicadores patógenos (Escherichia coli K88, E. coli O157: H7, Salmonella enteritidis, Enterococcus faecalis, Listeria monocytogenes y Staphylococcus aureus). Conclusões: O uso específico de B. sp. SM2 ou o uso combinado desta cepa junto com as cepas secretoras de enzimas extracelulares e tolerantes a ácidos ou bile, pode ser uma alternativa para substituir os antibióticos frequentemente usados como aditivos na alimentação animal.
ABSTRACT
Extracellular proteolytic activity was found in JSP1, an Antarctic bacterial isolate. The strain was related to Bacillus sp, based on 16S rRNA gene sequence analysis. The JSP1 protease was partially purified by ammonium sulfate precipitation. Optimal enzyme activity occurred at 40 C and pH 7.4. Enzyme activity was significantly enhanced in the presence of Mg2+ and Ca2+ and was completely inactivated in presence of Cu2+, Zn2+, Hg2+, EDTA and SDS. The enzyme hydrolyzed casein the most effectively among the protein substrates tested. The enzyme also exhibited relatively high activity on keratin and gluten, and was active against peptidyl conjugates such asL-Leu-p-Nitroanilide and N-Succinyl-L-Phe-p-Nitroanilide. This study suggests that JSP1 protease could be utilized as a potential environmentally-friendly feed additive in animal production.
Se reporta haber encontrado actividad proteolítica extracelular en una bacteria antártica denominada JSP1. Con base en el análisis de secuencia genética 16S ARNr, la cepa fué relacionada con Bacillus sp. La proteasa JSP1 fué parcialmente purificada por precipitación con sulfato de amonio. La actividad óptima de la enzima se produjo a 40 ºC y pH 7,4. La actividad enzimática fue significativamente mayor en presencia de Mg2+ y Ca2+ y se inactivó completamente en presencia de Cu2+, Zn2+ , Hg2+ , EDTA y SDS. Entre todos los sustratos ensayados, el más eficientemente hidrolizado por la enzima fue la caseína. La enzima tuvo actividad relativamente alta sobre la queratina y el gluten, y participó activamente contra conjugados peptídicos como la L-Leu-p-nitroanilida y la N-succinil-L-fenilalanina-p-nitroanilida. La enzima podría ofrecer potencial para su uso como aditivo alimenticio ecológico en producción animal.
A actividade proteolítica extracelular foi encontrada a partir de uma bactéria antárctica denominada JSP1, mediante uma análises de sequencia do gene 16S rRNA, a cepa foi relacionada para Bacillus sp. A proteasa JSP1 foi parcialmente purificada por precipitação com sulfato de amônia. Uma óptima actividade enzimática ocorreu em 40 ºC e pH 7,4. A actividade da enzima foi significativamente maior na presença de Mg2 + e Ca2 +, e foi completamente inactivada em presença de Cu2 + Zn2 +, Hg2 +, EDTA e SDS. A enzima hidrolisada de caseína foi mais eficaz entre os substratos de proteína testados, apresentando maior actividade na queratina e no glúten e foi activo contra os peptidil conjugados como L-Leu-p Nitroanilida e N-succinil-L-Phe-p-Nitroanilida. A enzima pode ser utilizado como aditivo ambiental na alimentação animal.